YC/T 282-2009 烟叶 游离氨基酸的测定 氨基酸分析仪法

犐犆犛６５．１６０

犡８７

备案号：—

２５９６５２００９

中华人民共和国烟草行业标准

／—

犢犆犜２８２２００９

烟叶游离氨基酸的测定

氨基酸分析仪法

ㅤㅤㅤㅤ

——

犜狅犫犪犮犮狅犾犲犪犳犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犱犻狊狊狅犮犻犪狋犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊

犃犿犻狀狅犪犮犻犱狊犪狀犪犾狕犲狉犿犲狋犺狅犱

狔

２００９０３３０发布２００９０５０１实施

国家烟草专卖局发布

／—

犢犆犜２８２２００９

烟叶游离氨基酸的测定

氨基酸分析仪法

１范围

本标准规定了烟叶中游离氨基酸的氨基酸分析仪测定方法。

本标准适用于烟叶中天冬氨酸（）、苏氨酸（）、丝氨酸（）、天冬酰胺（）、谷氨酸（）、

ＡｓｐＴｈｒＳｅｒＡｓｎＧｌｕ

脯氨酸（）、甘氨酸（）、丙氨酸（）、缬氨酸（）、胱氨酸（）、异亮氨酸（）、亮氨酸（）、酪

ＰｒｏＧｌＡｌａＶａｌＣｓＩｌｅＬｅｕ

ｙｙ

氨酸（）、苯丙氨酸（）、丙氨酸（）、氨基异丁酸（）、氨基丁酸（）、赖氨酸

ＴｒＰｈｅＡｌａＡｉａＡｂａ

ｙββββγγ

（）、组氨酸（）、色氨酸（）、精氨酸（）等种游离氨基酸的测定。

ＬｓＨｉｓＴｒＡｒ２１

ｙｐｇ

２规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

／—烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法

ＹＣＴ３１１９９６

３术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。ㅤㅤㅤㅤ

３．１

烟叶中游离氨基酸（）

犱犻狊狊狅犮犻犪狋犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱犳狉犲犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱犻狀狋狅犫犪犮犮狅犾犲犪犳

烟叶的盐酸浸出物中，以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸。

４原理

氨基酸为两性电解质，在酸性环境下形成阳离子。烟叶中的游离氨基酸经酸溶液萃取后，经氨基酸

分析仪的磺酸型锂离子交换柱分离，然后与茚三酮混合，通过加热反应，伯胺与之生成蓝紫色化合物，仲

胺与之生成黄色化合物。两种衍生物使用波长分别为和的双通道紫外检测器同时进行

５７０ｎｍ４４０ｎｍ

定性定量分析测定（氨基酸分析仪管路图参见附录）。

Ａ

５试剂

除特别要求以外，本标准所使用的试剂均为分析纯试剂，水为去离子水。

盐酸溶液，／。

５．１０．００５ｍｏｌＬ

准确移取浓盐酸（质量分数为）于容量瓶中，用水定容至刻度。此溶

４２０Ｌ３６％３８％１０００ｍＬ

μ～

液作为萃取溶液。

５．２样品稀释液，Ｈ２．２０。

ｐ

准确称取四水柠檬酸三锂１１．３ｇ，柠檬酸６．０ｇ，溶于５００ｍＬ水中，然后加入２０ｍＬ２５％（质量分

数）硫二甘醇溶液和１５ｍＬ３２％（质量分数）盐酸溶液。转移至１０００ｍＬ容量瓶中，用水进行定容。

５．３锂离子缓冲溶液１）

１）锂离子缓冲溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据所使用仪器的情况自行调整。

１

／—

犢犆犜２８２２００９

缓冲液，。

５．３．１ＡＨ２．９５

ｐ

准确称取四水柠檬酸三锂１１．３ｇ，柠檬酸６．０ｇ，溶于５００ｍＬ水中，然后加入５０ｍＬ甲醇溶液和

９ｍＬ３２％（质量分数）盐酸溶液，转移至１０００ｍＬ容量瓶中，用水进行定容。

缓冲液，。

５．３．２ＢＨ４．２０

ｐ

准确称取四水柠檬酸三锂１８．８ｇ，氯化锂４．２ｇ，溶于５００ｍＬ水中，然后加入６ｍＬ３２％（质量分

数）盐酸溶液，转移至１０００ｍＬ容量瓶中，用水进行定容。

缓冲液，。

５．３．３ＣＨ３．５０

ｐ

准确称取四水柠檬酸三锂１８．８ｇ，氯化锂５０．９ｇ，溶于５００ｍＬ水中，然后加入１０ｍＬ３２％（质量分

数）盐酸溶液，转移至１０００ｍＬ容量瓶中，用水进行定容。

５．４钾钠缓冲液，Ｈ５．５１。

ｐ

准确称取三水乙酸钠２７２．０，乙酸钾１９６．０，溶于２００ｍＬ乙酸［９９％１００％（质量分数）］中，转

ｇｇ～

移至１０００ｍＬ容量瓶中，用水进行定容。

５．５茚三酮溶液２）

准确称取茚三酮２０．０ｇ，苯酚２．０ｇ，溶于６００ｍＬ甲醇中，转移至１０００ｍＬ容量瓶中，用钾钠缓冲

液（）定容至刻度。此溶液应现配现用。

５．４

５．６还原剂

每茚三酮溶液（）中加入抗坏血酸。

１０００ｍＬ５．５０．２ｇ

５．７混合氨基酸标准储备液

本标准中所规定的种氨基酸的浓度均为／。

２１１．０ｍｏｌｍＬ

μ

５．８混合氨基酸标准工作溶液３）

分别移取一定量的混合氨基酸标准储备液（），用样品稀释液（）配制成各氨基酸浓度均为

５．７５．２

ㅤㅤㅤㅤ

／、／、／、／、／的系列混合氨基酸标准工作溶液。

５ｎｍｏｌｍＬ２０ｎｍｏｌｍＬ５０ｎｍｏｌｍＬ１００ｎｍｏｌｍＬ２００ｎｍｏｌｍＬ

该标准工作溶液在冰箱内可保存个月。

４℃３

６仪器

常用实验仪器以及下述各项。

旋风式样品磨：目筛网。

６．１６０

６．２分析天平：感量０．０００１。

ｇ

移液器：移液范围为和。

６．３５０Ｌ２００Ｌ２００Ｌ１０００Ｌ

μ～μμ～μ

６．４超声波振荡器：功率≥６０Ｗ。

６．５氨基酸分析仪（锂离子系统）：同时具有自动进样，梯度洗脱，以及双通道紫外检测的功能。

６．６高速离心机。

水相滤膜，。

６．７０．４５ｍ

μ

７分析步骤

７．１试样的制备

按照／—中的要求处理烟叶样品后，通过目筛过滤制备试样，并按照

ＹＣＴ３１１９９６６．１６０

／—中的要求测定试样的水分含量。

ＹＣＴ３１１９９６６．２

７．２测定次数

２）茚三酮溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据使用仪器的情况自行调整。

３）系列混合氨基酸标准工作液的浓度范围为推荐性的，操作者可根据操作习惯和所用仪器的灵敏度特点自行调

整，要求至少制备个工作标准溶液，且样品的浓度应在仪器的线性工作范围之内。

５

２

／—

犢犆犜２８２２００９

每个样品应平行测定两次。

７．３样品分析

７．３．１样品制备

称取约试样（）于磨口三角瓶中，精确至。准确加入盐酸溶液（），

１ｇ７．１１００ｍＬ０．０００１ｇ５．１５０ｍＬ

塞上塞子，室温下超声萃取。经离心后，取上清液，使用水相滤膜（）过滤后上机分析。

３０ｍｉｎ６．７

７．３．２氨基酸分析仪分析

７．３．２．１按照仪器说明书操作氨基酸分析仪。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适

用性。

———流动相：缓冲液（）；

ＡＡ５．３．１

———流动相：缓冲液（）；

ＢＢ５．３．２

———流动相：缓冲液（）；

ＣＣ５．３．３

———分离柱初始温度：；

３７℃

———反应管温度：；

１３０℃

———流动相流速：／；

０．４５ｍＬｍｉｎ

———茚三酮溶液流速：／；

０．２５ｍＬｍｉｎ

———进样体积：；

１００Ｌ

μ

———检测器：双通道紫外检测器，和。

５７０ｎｍ４４０ｎｍ

仪器梯度洗脱程序见表。

７．３．２．２１

表１梯度洗脱程序

／流动相／流动相／流动相／

ｔｍｉｎＡ％Ｂ％Ｃ％

０１００ㅤㅤㅤㅤ００

１１１００００

１２７９２１０

３４７９２１０

４６４２５８０

６１２０８００

６４０１０００

６９００１００

１２２００１００

７．３．３样品测定

用氨基酸分析仪测定系列混合氨基酸标准工作溶液（），得到种氨基酸的积分峰面积，用峰面

５．８２１

积为纵坐标，氨基酸浓度（／）为横坐标分别建立种氨基酸的标准工作曲线，相关系数应不小于

μｇｍＬ２１

。测定烟叶萃取样品，根据样品中氨基酸的峰面积计算种氨基酸的浓度。混合氨基酸标准

０．９９９５２１

溶液和烟叶样品的参考色谱图参见附录。

Ｂ

８结果计算

按式（）计算烟叶中种游离氨基酸的含量。

１２１

犮犞犽

××

狓…………（）

＝１

犿１狑

×－

（）

式中：

狓———样品中氨基酸的含量，单位为微克每毫克（／）；

ｍ

μｇｇ

３

／—

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———样品溶液中氨基酸仪的测定浓度，单位为微克每毫升（／）；

犮μｇｍＬ

———萃取溶液的体积，单位为毫升（）；

犞ｍＬ

犿———样品的质量，单位为毫克（）；

ｍｇ

犽———稀释倍数；

———试样的水分含量，。

狑％

以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至／。

０．００１ｍ

μｇｇ

９精密度、回收率和检出限

本方法的精密度、回收率和检出限试验研究结果参见附录。

Ｃ

１０检验报告

检验报告应包括以下内容：

———识别被测样品需要的所有信息；

———参照本标准所使用的试验方法；

———检测结果，包括各单次测定结果及其平均值；

———与本标准规定的分析步骤的差异；

———检测日期；

———检测人员。

ㅤㅤㅤㅤ

４

／—

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附录犃

（资料性附录）

氨基酸分析仪管路图

氨基酸分析仪管路图见图Ａ．１。

ㅤㅤㅤㅤ

图犃．１氨基酸分析仪管路图

５

／—

犢犆犜２８２２００９

附录犅

（资料性附录）

氨基酸色谱图示例

犅．１５７０ｎｍ处混合氨基酸标准溶液色谱图见图Ｂ．１。

ㅤㅤㅤㅤ

图混合氨基酸标准溶液色谱图（）

犅．１５７０狀犿

犅．２４４０ｎｍ处混合氨基酸标准溶液色谱图见图Ｂ．２。

图混合氨基酸标准溶液色谱图（）

犅．２４４０狀犿

６

／—

犢犆犜２８２２００９

犅．３５７０ｎｍ处烟叶样品溶液色谱图见图Ｂ．３。

图烟叶样品溶液色谱图（）

犅．３５７０狀犿

犅．４４４０ｎｍ处烟叶样品溶液色谱图见图Ｂ．４。

ㅤㅤㅤㅤ

图烟叶样品溶液色谱图（）

犅．４４４０狀犿

７

／—

犢犆犜２８２２００９

附录犆

（资料性附录）

精密度、回收率和检出限试验结果

本方法的精密度、回收率和检出限试验结果，见表Ｃ．１。

表犆．１方法的精密度、回收率和检出限试验结果

回收率

定性限／定量限／

氨基酸重复性／％

（／）（／ｍＬ）

加标浓度加入量／（／）回收率／μｇｍＬμｇ

ｍｇｇ％

空白０．２６６９８．４２

Ａｓｐ中低浓度０．０７５９９．２１４．９９０．０２３０．０７７

中高浓度０．２０５１０１．４６

空白０．２３８９８．２２

Ｔｈｒ中低浓度０．０１９９０．０７２．８７０．０２２０．０７３

中高浓度０．２０５９７．０７

空白０．２１０９８．０１

Ｓｅｒ中低浓度０．０４３９１．６５３．６４０．０１６０．０５３

中高浓度０．０９５９０．０３

空白０．２６４９７．６４

ㅤㅤㅤㅤ

Ａｓｎ中低浓度０．４１１９９．７４２．７９０．０２９０．０９７

中高浓度１．０７５１１０．８６

空白０．２９４９８．５５

Ｇｌｕ中低浓度０．０５９８８．０６６．１８０．０４８０．１６０

中高浓度０．１６８９６．３１

空白０．２３０９６．４１

Ｐｒｏ中低浓度１．２５８１００．０２２．５３０．１１００．３６７

中高浓度２．３６１１０３．８９

空白０．１５０９７．２４

Ｇｌｙ中低浓度０．０２１８７．２５６．８４０．０１００．０３３

中高浓度０．１６８８６．６４

空白０．１７８９５．４１

Ａｌａ中低浓度０．１０９９７．３７２．９９０．０１１０．０３７

中高浓度０．２４４９９．５９

空白０．２３４９９．８７

Ｖａｌ中低浓度０．０６５９１．０８３．６３０．０２５０．０８３

中高浓度０．１３６９４．１２

空白０．４８１１００．２９

Ｃｓ中低浓度０．０３９９０．９８６．１４０．０３３０．１１０

ｙ

中高浓度０．１１８９４．９２

８

／—

犢犆犜２８２２００９

表犆．１（续）

回收率

定性限／定量限／

氨基酸重复性／％

（／）（／ｍＬ）

加标浓度加入量／（／）回收率／μｇｍＬμｇ

ｍｇｇ％

空白０．２６２９９．１１

Ｉｌｅ中低浓度０．０３０８３．１７６．３８０．０２００．０６７

中高浓度０．０７０８４．８６

空白０．２６２９９．１１

Ｌｅｕ中低浓度０．０６９８６．２２３．５５０．０１９０．０６３

中高浓度０．１７５８５．７９

空白０．３６２９５．４８

Ｔｒ中低浓度０．０３８１０１．４４５．３４０．０４８０．１６０

ｙ

中高浓度０．０９５９８．０６

空白０．３３０９６．２５

Ｐｈｅ中低浓度０．０８１９２．０４３．５９０．０６１０．２０３

中高浓度０．１５５９５．３２

空白０．１７８９７．６５

βＡｌａ中低浓度０．０３５８５．３３５．３８０．０２６０．０８７

中高浓度０．０８０８５．１０

空白０．２０６９７．９４

ㅤㅤㅤㅤ

βＡｉａ中低浓度０．１０５９７．５３２．９６０．０２１０．０７０

中高浓度０．３１５１００．００

空白０．２０６９７．９４

γＡｂａ中低浓度０．０４１８９．６４２．３２０．０７６０．２５３

中高浓度０．０７０８８．９７

空白０．２９２９８．５

Ｌｓ中低浓度０．０２４９０．９８１．７８０．００６０．０２０

ｙ

中高浓度０．０５８９３．４１

空白０．３１０９７．９６

Ｈｉｓ中低浓度０．０７２８７．０６２．７７０．０１１０．０３７

中高浓度０．１６７８８．４０

空白０．４０８９７．１９

Ｔｒｐ中低浓度０．２４９８９．３７６．２２０．０７２０．２４０

中高浓度０．５２６８５．３４

空白０．３４８９８．７４

Ａｒｇ中低浓度０．０９８８５．１１６．４３０．００７０．０２３

中高浓度０．２９６８５．３４

９