DB12/T 840-2018 西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法

ICS65.020.20

B04

DB12

天津市地方标准

DB12/T840—2018

西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法

MethodofidentifyingseedpurityofwatermelonbyusingSSR-basedmarker

2018-11-07发布2018-12-01实施

天津市市场和质量监督管理委员会发布

DB12/T840—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。

本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科

学院农产品质量安全研究所。

本标准主要起草人：兰青阔、焦定量、赵新、王成、兰璞、焦荻、商纪鹏、陈锐、关海涛、张耀中、

焦贺敏。

I

DB12/T840—2018

西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法

1范围

本标准规定了西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。

本标准适用于西瓜单交种的纯度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标

准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

种子纯度seedpurity

种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子

粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。

3.2

聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)

一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。

3.3

简单重复序列simplesequencerepeat(SSR)

由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联

重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

3.4

分子标记molecularmarker

以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。

4原理

SSR分布于西瓜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术

将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行西瓜种子纯度鉴定。

5仪器设备及试剂

1

DB12/T840—2018

5.1仪器设备

PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；万分之一电子天平；

微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；

pH计等。

5.2试剂

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸

钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉

双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；

冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg2+的10×PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸

（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；GoldView染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馏

水或符合GB/T6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。

5.3溶液配制

相关溶液配制方法见附录A。

6方法步骤

6.1取样

检测样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料

各10份。

6.2单粒种子的DNA提取

6.2.1样品预处理

在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面

覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h35℃光照培养，8h28℃暗培养，待种子长出子叶

后备用。

6.2.2DNA提取

取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热

到65℃，每管放入400µL混合样品，将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，向

离心管中加入400µL24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10000g离心10min。将上清液200µL转

入另一支1.5mL离心管，加入400µL-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，

加入500µL乙醇——乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀。加入100µLTE（pH8.0）溶液溶解DNA。

6.2.3DNA的浓度和质量

将DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.1～0.8的区间内，测定并记录其在260nm和280nm的吸光

度。以1个OD260值相当于50mg/LDNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。

DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能复合检测要求。

6.3分子标记筛选

2

DB12/T840—2018

用28对核心引物进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互

补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。

6.4PCR扩增

6.4.1反应体系

总体积10μL，包括5μL超纯水、1μL含Mg2+的10×PCR缓冲液、0.8μLdNTPs（2.5mmol/L）、

0.6μLSSR引物（10μmol/L）、1μLTaqDNA聚合酶（2.5U/μL）、1μLDNA（30～50ng/μL），

混匀。

6.4.2反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环34次；72℃延伸10min；

-20℃保存备用。

6.5变性聚